Étude de la microflore des fromages du terroir québécois par métabarcoding - Mémoire Annick Raymond-Fleury Maîtrise en sciences et technologie des ...

Étude de la microflore des fromages du terroir
       québécois par métabarcoding

                           Mémoire

                   Annick Raymond-Fleury

Maîtrise en sciences et technologie des aliments - avec mémoire
                   Maître ès sciences (M. Sc.)

                       Québec, Canada

                © Annick Raymond-Fleury, 2020

Étude de la microflore des fromages du terroir
       québécois par métabarcoding

                        Mémoire

                Annick Raymond-Fleury

                  Sous la direction de :

           Steve Labrie, directeur de recherche

Résumé
L’industrie des fromages de spécialité occupe une place très importante au Québec. Sa
production annuelle représente plus de 60 000 tonnes de fromages. Bien que les produits
québécois se démarquent par leur haute qualité, ils manquent parfois de constances au
niveau de leurs propriétés sensorielles (goût, odeur, texture, couleur). Ces variations
peuvent être expliquées en partie par un déséquilibre de la microflore fromagère (bactéries
et mycètes). Bien que la microflore joue un rôle majeur dans le développement des
fromages, très peu d’information est disponible sur sa composition (présence et abondance
relative des espèces) pour les fromages du terroir québécois.

Le but de ce projet de recherche est de développer une méthode de métagénomique ciblée
par séquençage massif d’amplicons (metabarcoding) pour faire la caractérisation complète
de la microflore de la surface (croûte) et du cœur (pâte) de ces fromages. Le métabarcoding
est une méthode d’identification qui utilise une courte séquence d’ADN représentative du
génome entier. Les résultats obtenus lors de ce projet montrent que la région V3-V4 de
l’ADNr 16S, pour les bactéries, et la région ITS2 de l’espaceur de transcription interne, pour
les mycètes, sont les régions qui permettent de dépeindre le portrait le plus fidèle des
écosystèmes fromagers.

La microflore de 32 fromages du terroir québécois a été caractérisée. Les régions cibles
utilisées recensent les genres dominants associés aux écosystèmes fromagers et
permettent aussi la détection spécifique de certains genres moins fréquents. Le nombre de
genres dominants identifiés est de 20 pour la région V3-V4, de 22 pour la région V6-V8, de
12 pour la région ITS1 et de 13 pour la région ITS2. Il a également été possible de comparer
la communauté microbienne de 15 fromages pour deux années de production (2015 et
2018, 30 fromages au total) afin d’observer la variation de la microflore en fonction du temps.
Cette étude a permis d’observer que plus de la moitié des écosystèmes étudiés se révèle
être constante. Ces nouvelles connaissances permettent de mieux décrire la typicité des
fromages québécois et de proposer des leviers technologiques aux artisans pour produire
des fromages de haute qualité de façon plus constante.

                                               ii

Abstract
The speciality cheese industry plays an important role in the province of Quebec, with a
production of over 60 000 tonnes of cheeses. Although these products distinguish
themselves with their high quality, a lack of constancy is sometime experienced regarding
their sensory properties (taste, smell, texture, color). These variations can be explained,
partly, by a microflora disequilibrium (bacteria and fungi). Even though microflora plays an
important role in cheese ripening, very little information is available about his composition
(presence and relative abundance of different species) for Quebec’s terroir cheeses.

This research project aims to develop a targeted metagenomic by massive amplicon
sequencing (metabarcoding) to characterize the microflora of cheese rind and cheese core.
Metabarcoding is a profiling method using short sequences representative of the entire
genome. In this project, the V3-V4 region of the 16S rDNA and the ITS2 region of the rDNA
ITS region were identified as the most precise molecular markers for the profiling of
respectively bacterial and fungal cheese ecosystems.

The microflora of 32 cheeses of the Quebec terroir has been characterized. The target
regions used identified the dominant genera associated with cheese ecosystems and also
allow the specific detection of some less frequent genera. The number of dominant genus
assigned is 20 for the V3-V4 region, 22 for the V6-V8 region, 12 for the ITS1 region and 13
for the ITS2 region. It was also possible to compare the microbial community of fifteen
cheeses for two different years of production (2015 and 2018) in order to observe the
variation of the microflora over time. This study shows that over half of the ecosystems
analyzed are stable. This new knowledge allows a better understanding of Quebec’s terroir
cheese typicity and offers new information to cheesemakers on the way to produce high
quality cheeses more consistently.

                                             iii

Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................................... ii
Abstract............................................................................................................................................................... iii
Table des matières ............................................................................................................................................. iv
Liste des figures ................................................................................................................................................. vii
Liste des tableaux ................................................................................................................................................ x
Liste des acronymes ........................................................................................................................................... xi
Remerciements .................................................................................................................................................. xii
Avant-propos .................................................................................................................................................... xiii
Introduction ......................................................................................................................................................... 1
Chapitre 1 – Revue de littérature ........................................................................................................................ 3
    1.1          Fabrication fromagère ....................................................................................................................... 3
    1.2          La microflore des fromages ............................................................................................................... 4
        1.2.1        La microflore bactérienne primaire des fromages ......................................................................... 4
        1.2.2        La microflore bactérienne secondaire et la microflore d’affinage des fromages ........................... 6
        1.2.3        La microflore fongique utile des fromages .................................................................................... 8
        1.2.4        La microflore dépendante du type de technologie fromagère ..................................................... 10
        1.2.5        La microflore et la production d’arômes ...................................................................................... 12
    1.3          La typicité fromagère et la notion de terroir ..................................................................................... 12
    1.4          Les méthodes d’identification du microbiote fromager .................................................................... 13
        1.4.1        Les analyses phénotypiques de microorganismes isolés ........................................................... 13
        1.4.2        Les analyses moléculaires non ciblées ....................................................................................... 14
        1.4.3        Le séquençage du génome complet d’un organisme.................................................................. 17
        1.4.4        Le barcoding ............................................................................................................................... 18
        1.4.5        Le métabarcoding ....................................................................................................................... 18
    1.5          La notion d’unité taxinomique opérationnelle .................................................................................. 21
    1.6          La biodiversité ................................................................................................................................. 22
        1.6.1        Indice de richesse ....................................................................................................................... 22
        1.6.2        Indice d’alpha-diversité ............................................................................................................... 22
        1.6.3        Indice de bêta-diversité ............................................................................................................... 23
    1.7          L’analyse bio-informatique .............................................................................................................. 23
        1.7.1        Le nettoyage des séquences ...................................................................................................... 24

                                                                                    iv

1.7.2       L’appariement des séquences .................................................................................................... 26
       1.7.3       L’élimination des séquences chimériques................................................................................... 26
       1.7.4       Le regroupement des séquences en UTOs ................................................................................ 27
       1.7.5       L’assignation taxinomique ........................................................................................................... 29
   1.8         Les applications du métabarcoding ................................................................................................. 29
Chapitre 2 – Problématique, hypothèse et objectifs.......................................................................................... 31
   2.1         Problématique ................................................................................................................................. 31
   2.2         Hypothèse de recherche ................................................................................................................. 32
   2.3         Objectifs de recherche .................................................................................................................... 32
Chapitre 3 – Persistence of Quebec’s terroir cheese microflora using metabarcoding..................................... 33
   3.1         Résumé ........................................................................................................................................... 33
   3.2         Abstract ........................................................................................................................................... 34
   3.3         Importance ...................................................................................................................................... 34
   3.4         Introduction...................................................................................................................................... 35
   3.5         Results ............................................................................................................................................ 36
       3.5.1       Sequencing Data and Taxonomic Assignation............................................................................ 36
       3.5.2       Choice of the Targets for Cheese Microflora Metabarcoding ...................................................... 38
       3.5.3       Microbial Landscape of Quebec’s Terroir Cheeses .................................................................... 41
       3.5.4       The Consistency of Cheese Ecosystems.................................................................................... 46
   3.6         Discussion ....................................................................................................................................... 47
       3.6.1       Selecting the Genomic Target for Cheese Metabarcoding ......................................................... 47
       3.6.2       Assessing the Stability of Quebec’s Terroir Cheese Microflora Over Years ............................... 48
   3.7         Materials and Methods .................................................................................................................... 51
       3.7.1       Cheese sampling ........................................................................................................................ 51
       3.7.2       DNA Extraction, Library Construction and Sequencing............................................................... 51
       3.7.3       Accession Number ...................................................................................................................... 52
       3.7.4       Bioinformatic Analysis ................................................................................................................. 52
       3.7.5       Metrics and Figures..................................................................................................................... 53
       3.7.6       Acknowledgement ....................................................................................................................... 53
Chapitre 4 – Discussion générale ..................................................................................................................... 54
   4.1         Retour sur les résultats ................................................................................................................... 54
   4.2         Limites de l’étude ............................................................................................................................ 55
   4.3         Retour sur l’hypothèse de recherche............................................................................................... 55

                                                                                 v

Conclusion générale et perspective .................................................................................................................. 56
Bibliographie ..................................................................................................................................................... 57

                                                                                  vi

Liste des figures
Figure 1 Aspect visuel de fromages de spécialité. (A) Fromage à croûte lavée, de couleur
orangée. (B) Fromage à croûte mixte, dont l’apparence est intermédiaire. (C) Fromage à
croûte fleurie, dont la surface est blanche et duveteuse. ……………….……………………..10

Figure 2 Schématisation du séquençage de Sanger. (À gauche) Représentation de la
migration des fragments générés à la suite de la réaction de polymérisation sur gel
d’électrophorèse capillaire et détection de la couleur associée à chaque ddNTP. (À droite)
Représentation du fragment synthétisé par polymérisation à la suite de l’arrêt lors de
l’incorporation d’un ddNTP à l’extrémité 3’ et déduction de la séquence d’ADN
résultante............................................................................................................................15

Figure 3 Technologie de séquençage à haut débit d’Illumina. (À gauche) Simple brin d’ADN
fixé à la plaque par un adaptateur, auquel une amorce est hybridée afin de débuter
l’élongation, en présence de nucléotides terminateurs réversibles fluorescents. (Au centre)
À la suite de l’ajout du nucléotide, un signal lumineux est émis et la fluorescence est
interprétée par une caméra. (À droite) Cette opération se réalise en parallèle à plusieurs
endroits sur la plaque. L’ensemble des signaux est compilé afin de connaître la séquence
de chaque fragment…………………………………………….………………………………...18

Figure 4 Représentation des cibles de l’ADNr bactérien (A) et fongique (B) utilisées en
métabarcoding. (A) L’ADNr 16S bactérien comporte neuf régions hypervariables, numéroté
de V1 à V9. (B) L’ADNr fongique présente deux espaceurs de transcription interne, ITS1 et
ITS2……………………………………………….…………………………………………..……21

Figure 5 Importance de la richesse (en haut) et de l’équitabilité (en bas) pour la définition
de la diversité. (En haut) Une communauté de 7 espèces semble plus diverse qu’une
communauté de 2 espèces. (En bas) À richesse égale, une communauté moins équitable
(à gauche) semble moins diverse. (À gauche) Une communauté moins riche (en haut) peut
sembler plus diverse si elle est plus équitable. (À droite) Idem pour la communauté du
bas...………………………………………….………………………………………………….…22

                                                                   vii

Figure 6 Principe de la fenêtre glissante de Trimmomatic. L’analyse de la qualité est
effectuée une première fois, puis si la valeur est au-dessus du seuil fixé, l’analyse se
poursuit avec un décalage d’un nucléotide en aval. L’analyse se poursuit jusqu’à ce que la
qualité dans l’étendue de la fenêtre soit inférieure au seuil fixé…....................................….25

Figure 7 Appariement des séquences sens et anti-sens. La région d’intérêt, dont la
séquence exacte n’est pas connue est ciblée par des amorces (flèches rouges). Cela produit
des séquences sens (R1) et anti-sens (R2) que l’on peut ensuite apparier afin de connaître
la séquence de la région d’intérêt…………………………………………………………...…...26

Figure 8 Formation d’une chimère lors de l’amplification PCR. (A) Brin d’ADN dont
l’extension a été interrompue prématurément lors d’un cycle de PCR (en noir). (B) Ce court
brin peut s’hybrider à un brin d’ADN d’une autre origine et partiellement homologue (en gris),
permettant quelques mésappariements (hétéroduplex). (C) La courte séquence sert
d’amorce et il y a élongation du court brin. (D) Cette séquence chimérique (grise et noire)
sera amplifiée dans les cycles suivants de PCR, mais ne correspond pas à une molécule
d’ADN retrouvée dans l’écosystème…..……………………….………………………..……...27

Figure 9 Schématisation de l'approche par seuil d’identité et par Swarm. (A) Visualisation
de la formation des UTOs, selon un seuil d’identité (t) (généralement 97 %). Le choix de la
première séquence (en rouge) a un impact sur la formation des UTOs, car des amplicons
étroitement liés peuvent être placés dans différents UTOs. (B) Swarm fait des
regroupements de façon itérative, en utilisant un petit seuil de regroupement (d), choisi par
l'utilisateur,   permettant      aux      UTOs       de     regrouper      toutes     les     séquences
semblables…………………………………………………………….…………………………..28

Figure 10 Compared distribution of the most abundant eukaryotic orders in cheese
ecosystems………………………………………………………………………………………..39

Figure     11    Compared      distribution    of   the    most    abundant      bacteria    in   cheese
ecosystems……………………………………………………………………………....………..40

Figure 12 Compared distribution of the most abundant eukaryotic genera in cheese
ecosystems…………………………………………………………………………..……………42

                                                    viii

Figure 13 Compared distribution of the most abundant bacterial genera in cheese
ecosystems…………………………………………………………………………......…………43

                                      ix

Liste des tableaux
Tableau 1 Odeur des composés volatils issus du métabolisme de la microflore
fromagère…………………………………………………………………………………….……12

Tableau 2 Comparaison des plateformes de NGS.……………….…………………………...17

Tableau 3 Régions cibles de l’ADNr utilisées pour étudier les écosystèmes fromagers...…20

Tableau 4 Caractéristiques des outils pour le nettoyage des séquences Illumina...………..25

Table 5 Information on cheese sampled………………………..…………………………..…..37

Table 6 Sequencing data of the fungal (ITS1 and ITS2) and bacterial (V3-V4 and V6-V8)
ecosystems………………………………………………………………………………………..37

Table 7 Richness and diversity of cheese microflora……………………………………….....44

Table 8 Constancy of cheese microbiota according to the Bray-Curtis index……………….46

Table 9 Primer sequences for the preparation of the samples………………….……............52

                                            x

Liste des acronymes
ADNr : acide désoxyribonucléique ribosomique;

AEM : Applied and Environmental Microbiology;

dNTP : désoxyribonucléotides;

ddNTP : didésoxyribonucléotides;

FAO : Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (en anglais, food
and agriculture organization of the United Nations);

HTS : séquençage à haut débit (en anglais, high-throughput sequencing);

IBIS : Institut de biologie intégrative et des systèmes;

ITS : internal transcribed spacer;

N.A. : Not available;

NGS : séquençage de nouvelle génération (en anglais, next-generation sequencing);

OTU : operational taxonomic unit;

pb : paire de bases;

PCR : réaction en chaîne de la polymérase (en anglais, polymerase chain reaction);

PEAR : Paired-End reAd mergeR;

qPCR : PCR quantitative;

T-RFLP: polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (en anglais,
terminal restriction fragment-length polymorphism);

UTO : unité taxinomique opérationnelle.

                                               xi

Remerciements
Je tiens à remercier toute l’équipe du laboratoire de mycologie alimentaire, et tout
particulièrement mon directeur de recherche, Steve Labrie, qui a cru en mon potentiel. Merci
Steve de m’avoir accompagné, conseillé et encouragé tout au long de mon parcours. J’ai
toujours senti que ta porte m’était grande ouverte, ce que j’ai grandement apprécié. Je
remercie Marie-Hélène Lessard pour sa disponibilité et son aide précieuse. Je remercie
également tous les membres de l’équipe qui ont contribué de près ou de loin à la réussite
de ces travaux : Catherine Viel, Andréanne, Stéphanie, Vincent, Gabrielle, Laura, Virginie
et Momo. Je remercie aussi tous les étudiants en Sciences des aliments qui ont croisé ma
route et qui ont contribué à ma culture scientifique.

Un grand merci à mon co-directeur Daniel St-Gelais pour ses discussions constructives et
ses connaissances complémentaires qui ont su m’éclairer aux moments opportuns.

Je remercie tous les partenaires financiers qui ont permis la réalisation de ces travaux et je
tiens à souligner la participation des nombreux fromagers qui ont accepté de collaborer à
cette étude. Sans vous, rien de tout cela n’aurait été possible. Merci de votre confiance et
de votre générosité!

Pour conclure, je ne saurais exprimer toute ma gratitude envers ces deux personnes qui
m’ont permis de surmonter ce défi et de parvenir à l’aboutissement de ce périple : Julien
Chamberland et Steven Gallant. Merci Julien de m’avoir partagé ta bonne humeur
contagieuse, ton énergie positive et d’avoir été une source intarissable de conseils. Tu auras
su me guider alors que j’en avais le plus besoin. Merci Steven d’avoir été le support moral
dont j’ai eu si souvent besoin. Merci de m’avoir accompagné à travers cette tumultueuse
aventure, et d’accepter d’en partager une encore plus grande et merveilleuse très bientôt.

                                              xii

Avant-propos
Ce mémoire est divisé en cinq sections. La première section est l’introduction, qui met en
contexte la problématique de ce projet de maîtrise. La deuxième section est une revue de
la littérature résumant les connaissances actuelles sur la microflore des fromages et les
méthodes disponibles afin de la caractériser. Cette section se termine par la présentation
de la problématique de recherche, l’hypothèse et les objectifs de ce projet de maîtrise.

La troisième section est écrite sous forme d’article scientifique, en anglais, et présente tous
les résultats obtenus dans le cadre de ce projet. L’article sera soumis pour publication dans
la revue scientifique Applied and Environmental Microbiology (AEM). L’auteure de ce
mémoire a réalisé la plus grande partie du travail expérimental, dont l’élaboration du
protocole bio-informatique, de l’analyse des résultats et de la rédaction de l’article
scientifique, dont elle est la première auteure. Le séquençage a été réalisé par la plateforme
d’analyse génomique de l’institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS) de
l’Université Laval. Le Dr Julien Chamberland a participé activement à l’élaboration initiale
du protocole d’analyse bio-informatique et à l’écriture de l’article scientifique, lors de ses
études sous la direction du Dr Yves Pouliot. Les Drs Julien Chamberland, Éric Dugat-Bony,
Sylvie Turgeon et Daniel St-Gelais ont participé à la révision de l’article scientifique. La Dre
Marie-Hélène Lessard a cosupervisé le travail, a contribué à la correction du mémoire et a
participé à l’écriture de l’article scientifique. Le Dr Steve Labrie a obtenu les fonds de
recherche, a supervisé le travail, a contribué à la révision de l’article et a participé activement
à l’écriture du mémoire. La majorité des résultats de cet article ont été présentés sous forme
d’affiche intitulée « Étude de la typicité des fromages québécois par métabarcoding » lors
du Forum technologique Novalait à Saint-Hyacinthe (Québec, Canada) en 2018.

La quatrième section offre une discussion générale sur les travaux présentés dans le
mémoire, afin de révéler les principaux résultats de ce projet de maîtrise et de mettre de
l’avant l’importance de ces découvertes, ainsi que les limitations de cette étude. La
cinquième et dernière section est une conclusion générale et présente les perspectives du
projet.

                                                xiii

Introduction
L’industrie fromagère occupe une place très importante au Canada. Au pays, 510 250
tonnes (t) de fromages ont été produites en 2018. Près du tiers (164 403 t – 32 %) de la
production est associée à la catégorie des fromages de spécialité [1]. Le Québec joue un
rôle de premier plan dans cette transformation, puisqu’on y produit annuellement près du
tiers des fromages de spécialité au pays.

On retrouve 535 fromages fermiers et artisanaux au Québec, dont 315 sont fabriqués à
partir de lait de vache [2]. Ces fromages rencontrent souvent les plus hauts standards de
qualité et remportent des prix prestigieux [3], mais ils manquent parfois de constance au
niveau de leurs caractéristiques sensorielles. Cette inconstance provient en grande partie
du lait utilisé pour leur fabrication, de sa composition microbiologique et de ses propriétés
technologiques. Bien que la microflore joue un rôle majeur dans le développement des
propriétés sensorielles des fromages, très peu d’information est disponible sur sa
composition (présence et abondance relative) pour les fromages du terroir québécois. Le
recensement des écosystèmes fromagers permet d’identifier les microorganismes jouant un
rôle d’intérêt dans l’affinage des fromages.

Les fromages de spécialité développent une microflore riche et diversifiée, tant en surface
que dans la pâte du fromage. La matière première, le lait, est inoculée par un mélange
complexe de ferments d’acidification et d’affinage qui contribuent aux caractéristiques
sensorielles   des   fromages    [4].   Cependant,    la microflore secondaire       provenant
majoritairement de l’environnement va également s’établir au fil du temps pouvant même
devenir majoritaire dans certaines variétés. Cet écosystème dynamique complexe évolue
d’une façon difficile à prévoir et à contrôler dans le produit final. Ceci est principalement dû
à la méconnaissance de toutes les espèces microbiennes qui se développent et des
paramètres de fabrication qui les affectent. La compréhension de l’écosystème fromager est
nécessaire afin de contribuer au contrôle de l’affinage des fromages [5-7].

Pendant plusieurs dizaines d’années, des méthodes de microbiologie traditionnelle ont été
utilisées afin de caractériser l’écosystème fromager [8]. Cependant, les méthodes de culture
ne permettent pas de détailler l’ensemble de l’écosystème fromager puisque plusieurs
espèces de microorganismes peuvent être difficilement cultivables ou être dans un état de

                                               1

survie nommé « viable, mais non-cultivable » [9, 10]. Également, les méthodes de culture
ont souvent tendance à favoriser la détection des microorganismes majoritaires au
détriment des espèces minoritaires. Dans les dernières années, de nouvelles méthodes
comme la métagénomique et le métabarcoding ont fait leur apparition permettant d’évaluer
les espèces composant la microflore globale et leur abondance relative dans un
écosystème. Ceci a permis de détecter des microorganismes dont la présence était
insoupçonnée jusqu’alors [7, 11]. Ces études ont été réalisées pour des fromages de
plusieurs origines à travers le monde. Celles-ci montrent que le portrait de la composition
microbienne et la complexité de la microflore varient d’une variété de fromages à l’autre [7,
12, 13]. Pour les fromages à croûte lavée, plus d’une centaine de microorganismes ont pu
être identifiés alors que moins d’une dizaine d’espèces sont inoculées lors du procédé de
fabrication/affinage [6, 7, 14]. Il est aussi possible de suivre les activités métaboliques de
plusieurs espèces lors de l’affinage des fromages à l’aide de la transcriptomique [12, 13].

Les fromagers d’ici sont à la recherche de connaissances et de moyens permettant de
réduire l’impact des inconstances de qualité. Une meilleure compréhension de la microflore
fromagère permettrait de fournir des leviers technologiques aux artisans afin de mieux
contrôler l’affinage de leurs fromages et d’identifier les espèces typiques à leur production
[15]. En caractérisant les écosystèmes, il serait éventuellement possible de modifier les
cultures d’appoints inoculées au lait lors de la préparation des fromages, permettant ainsi
une « standardisation » de la microflore lors de la production fromagère.

Au Québec, la caractérisation fongique et chimique des laits servant à la fabrication de
fromages du terroir québécois a été réalisée [16] et trois levures d’intérêt dans l’affinage des
fromages du terroir ont été étudiées pour leur capacité fromagère [17]. Cependant, à ce
jour, aucune étude utilisant des méthodes issues de la génomique n’a été utilisée afin de
décrire l’écosystème des fromages d’ici. Ce projet de recensement par l’utilisation du
métabarcoding pour caractériser les fromages de plusieurs fromageries du terroir est une
première et vise une meilleure compréhension de la microflore des fromages et de la typicité
des fromages québécois.

                                               2

Chapitre 1 – Revue de littérature

1.1 Fabrication fromagère
Le fromage est un produit alimentaire élaboré à base de lait. L’origine animale du lait peut
être aussi diverse qu’il existe de mammifères, mais les plus communs sont les fromages à
base de lait de vache, de chèvre, de brebis et de bufflonne [18]. La composition du lait
(teneur en protéines et en matières grasses, par exemple) et sa microflore varient en
fonction des mammifères, ce qui peut générer différents profils de propriétés sensorielles
[18]. Le lait utilisé en production fromagère peut être soumis, ou non (lait cru), à un
traitement thermique (lait pasteurisé ou thermisé), ce qui aura une incidence sur la charge
microbiologique initiale du lait [19-21].

La fabrication du fromage débute par l’ajout de chlorure de calcium (CaCl2), de ferments
lactiques et d’enzymes, telles que la présure, ce qui entraîne la coagulation des micelles de
caséines (coagulation lactique ou enzymatique). Pour les fromages affinés en surface,
l’ajout des ferments d’affinage directement dans le lait permet leur meilleure répartition dans
l’ensemble du caillé, mais ceux-ci peuvent également être déposés sur les fromages par
vaporisation et lors des soins de croûte (lavage) dans le cas des affinages en surface [22].
L’étape de coagulation, influencée par la concentration d’enzymes, la quantité de calcium,
le pH et le temps d’entreposage [4], provoque la formation d’un gel. Lorsqu’il est découpé
et brassé, le gel génère deux phases, soit le caillé et le lactosérum, qui sont séparées lors
de l’égouttage. Le caillé récupéré est alors mis en moule et retourné pour éliminer le
lactosérum. L’égouttage peut se faire lentement, par gravité, pour les fromages à pâte molle,
ou de façon accélérée par pressage et parfois par cuisson, pour les fromages à pâte semi-
ferme et ferme [4]. Généralement, une fois l’égouttage terminé, les fromages sont démoulés
puis salés par immersion en saumure ou par salage à sec [4]. Pour certaines variétés, ces
dernières étapes peuvent avoir lieu dans un ordre différent. Les fromages frais sont alors
prêts à la consommation.

La majorité des variétés de fromages démoulés passent par une étape finale d’affinage dans
des conditions contrôlées d’humidité et de température. Pendant cette période, qui peut être
de quelques jours (ex. Port-Salut) à plusieurs mois (ex. Cheddar), les ferments d’affinage et
la microflore secondaire se développent, ce qui confère aux fromages leurs caractéristiques

                                              3

sensorielles typiques [4]. Les fromages à croûte fleurie, comme le Camembert et le Brie, se
recouvrent de levures et de moisissures qui leur confèrent une apparence duveteuse, tandis
que les fromages à croûte lavée (généralement frottés à quelques reprises avec une
solution saline contenant des ferments d’affinage) se recouvrent d’une croûte humide et
souvent orangée composée principalement de bactéries (ex. Brevibacterium sp.,
Glutamicibacter sp.) et de quelques espèces de levures (ex. Geotrichum sp.,
Debaryomyces sp., Kluyveromyces sp.) [23].

Ces différentes étapes sont autant de leviers technologiques qui permettent aux maîtres-
fromagers d’obtenir différentes variétés de fromages possédant chacune des propriétés
texturales et organoleptiques qui leur sont propres. Les fromages peuvent être classés selon
les technologies utilisées, telles que le type de coagulation (caillé de type lactique, présure
ou mixte), le taux d’humidité (pâte molle, semi-ferme ou ferme) ou le type de croûte (fleurie,
lavée ou mixte), pour en nommer que quelques-unes [24].

1.2 La microflore des fromages
La microflore des fromages est composée d’un grand nombre de microorganismes qui peut
atteindre entre 2 x 109 et 3 x 109 UFC/g de fromage [4]. Il s’agit d’un ensemble de bactéries,
de levures et de moisissures qui proviennent à la fois de l’environnement et d’inoculations
volontaires (ferments et cultures d’affinage). La distribution de la microflore est très
hétérogène au sein d’un même fromage, la composition microbiologique (quantité, diversité)
varie énormément entre la surface (croûte) et le cœur de la meule (pâte) [25].

1.2.1   La microflore bactérienne primaire des fromages

Lors de la fabrication fromagère, les ferments lactiques et d’affinage sont ajoutés
directement dans le lait avant d’être mélangés. Ce sont les microorganismes qui ont souvent
un rôle dans l’acidification du lait et/ou la génération de composés aromatiques. Après le
démoulage, le fromage prend sa forme définitive, et le cœur de la meule n’est plus en
contact avec l’environnement extérieur. Les microorganismes retrouvés dans la pâte et à la
surface de fromages frais ou peu affinés (fromage en début d’affinage, Mozzarella)
correspondent aux ferments ajoutés lors de la production [4, 26-28]. La microflore
bactérienne se compose généralement des ferments lactiques, appartenant aux genres
bactériens Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc et Lactobacillus [29, 30]. Les

                                              4

bactéries lactiques, qui contribuent à l’acidification du caillé, favorisent l’implantation d’une
microflore acidophile, soit les levures et les moisissures filamenteuses [31, 32].

Le genre Lactococcus est couramment utilisé comme ferment lactique d’acidification. En
début d’affinage, les lactocoques sont dominants, avec plus de 109 UFC/g de fromage [4].
Les sous-espèces Lactococcus lactis subsp. lactis et L. lactis subsp. cremoris sont les plus
utilisées [33]. Ces bactéries ont un rôle majeur dans la production des fromages puisqu’elles
métabolisent le lactose en acide lactique, ce qui acidifie le milieu (fermentation lactique) et
permet la coagulation des caséines. De plus, les lactocoques ont une importante activité
protéolytique et leur principale enzyme, la protéase PrtP, est une protéine kinase qui a la
capacité d’hydrolyser les caséines [34]. Les lactocoques diminuent le potentiel redox en
début d’affinage et contribuent aux flaveurs des fromages de type Cheddar, Gouda ou Saint-
Paulin par la production de métabolites secondaires (acétaldéhyde, éthanol, acide acétique)
[35]. Cependant, certaines souches de Lactococcus sp. ont une activité indésirable lors de
l’affinage en contribuant à l’amertume des fromages [34].

Streptococcus thermophilus est une espèce thermophile (croissance optimale entre
40-45 C) souvent utilisée en combinaison avec d’autres bactéries lactiques pour la
fabrication de fromages à pâte pressée (ex. Emmental, Gruyère, Gorgonzola) [36] et à pâte
molle stabilisée [4]. En effet, cette espèce peut être utilisée pour raffermir la pâte de
fromages à croûte fleurie, pour produire des fromages dits à pâte stabilisée [37]. Son rôle
au cours de l’affinage est semblable à celui des lactocoques, mais leur production en
acétaldéhyde est beaucoup plus importante et confère des arômes de fraicheur recherchés
chez les variétés des fromages concernées [4].

Leuconostoc mesenteroïdes est surtout utilisé pour sa production de diacétyle et
d’acétoïne, des composés qui confèrent un goût de beurre aux fromages [38]. Ces bactéries
hétérofermentaires produisent également de l’éthanol et de l’acide acétique qui contribuent
aux arômes des fromages et du dioxyde de carbone (CO2) qui mène à l’apparition
d’ouvertures dans la pâte [4, 39, 40]. La charge microbienne de Leuconostoc est très
variable selon les variétés de fromages, allant de 103 à 109 UFC/g, et ils sont habituellement
très abondants dans les fromages élaborés à partir de lait cru [4, 41].

                                               5

Les Lactobacillus sp. se retrouvent en grand nombre (107-108 UFC/g de fromage) dans
les pâtes pressées cuites. Les lactobacilles sont le plus souvent utilisés comme culture
d’appoint [42]. Ils ont un rôle mineur dans l’acidification du caillé, mais interviennent pendant
l’affinage des fromages par leurs activités protéolytiques, peptidasiques, lipasiques et
estérasiques [43]. Leur activité protéolytique est la plus importante parmi les bactéries
lactiques et leur activité estérasique est à l’origine de la production d’arômes fruités [44].
Lactobacillus helveticus et L. delbrueckii sont les espèces les plus utilisées dans les
ferments lactiques et les cultures d’appoint.

1.2.2    La microflore bactérienne secondaire et la microflore d’affinage des fromages

Les bactéries ensemencées comme ferments d’affinage se retrouvent principalement à la
surface des fromages [31]. Les bactéries corynéformes et psychrohalotolérantes sont les
principaux groupes bactériens participant à l’affinage des fromages [45, 46]. Bien que leur
présence soit confirmée depuis longtemps, leur rôle dans l’affinage n’est pas toujours bien
connu.

Les bactéries corynéformes, dont l’observation microscopique révèle des bâtonnets de
forme     irrégulière,   comprennent     les    genres    Brevibacterium,     Brachybacterium,
Corynebacterium, Glutamicibacter et Microbacterium [31, 47, 48]. Bien que ces bactéries se
retrouvent de façon omniprésente dans l’environnement, plusieurs espèces ont été isolées
à partir de différentes variétés de fromages [31]. Les colonies de ce groupe de bactéries
sont colorées (jaune, orange, beige ou rouge-beige). Les corynéformes se retrouvent, entre
autres, à la surface des fromages Brick, Limburger, Romadour, Weinkase, Harzer
Handkäse, Münster, Camembert, Appenzeller et Esrom [31, 49, 50].

Les bactéries du genre Brevibacterium sont aérobies, mésophiles, halotolérante (jusqu’à
15 % NaCl) et produisent des caroténoïdes (pigments jaunes et oranges) [51].
Brevibacterium linens est une bactérie dominante des fromages à croûte lavée,
représentant jusqu’à 30 % de la microflore [31]. Ses enzymes protéolytiques et lipolytiques
contribuent de façon déterminante à l’affinage des fromages Limburger, Münster, Brick,
Tilsit et Appenzeller [31]. B. linens présente des activités peptidiques, estérolytiques et anti-
Listeria [52]. Elle produit des composés volatils soufrés, comme le sulfure d’hydrogène, le
méthanethiol et le sulfure de diméthyle en plus de l’ammoniaque [53, 54]. L’espèce

                                                6

B. aurantiacum est impliquée dans l’affinage de plusieurs fromages irlandais, tels que le
Gubbeen, l’Ardrahan et le Durrus [55].

Les espèces Brachybacterium tyrofermentans et B. alimentarium ont été isolées de la
surface de fromages Gruyère et Beaufort [31]. Ces espèces sont anaérobies facultatives,
halotolérantes (~15 % de NaCl) et leur croissance est optimale à 30 C à un pH de 7,3 [56].
Ces bactéries corynéformes, dont la croissance est optimale à une température entre 20 et
30 C, se distinguent par leur capacité à produire de la ménaquinone (vitamine K 2) [56].

Les principales espèces de Corynebacterium répertoriées dans les écosystèmes
fromagers sont C. variabile, C. casei, C. mooreparkense et C. flavescens. Les espèces
appartenant à ce genre réalisent le catabolisme des acides aminés, possède des activités
lipolytiques et protéolytiques et produit de l’ammoniaque ainsi que des composés sulfurés,
tel que le méthanethiol [54]. Certaines espèces ont une activité estérase [31, 57]. Les
Corynebacterium sp. produisent des colonies jaunes ou beige-jaune et sont aérobies
facultatives [4, 50]. Dans l’environnement, on les retrouve dans le sol, à la surface des
plantes et dans les eaux usées [31].

À ce jour, seules deux espèces de Microbacterium ont été retrouvées dans les fromages,
soit Microbacterium lacticum, de couleur blanche-jaunâtre, et M. gubbeenense, de couleur
beige ou beige-rouge [5, 49]. M. lacticum possède une activité anti-Listeria dans les
fromages [58]. Ces espèces produisent de l’acide méthylbutyrique, de l’acide caproïque et
du phényléthanol qui contribuent aux arômes des fromages [59]. Les Microbacterium sont
généralement retrouvés en petite proportion et de façon sporadique à la surface des
fromages à croûte lavée [49].

Les bactéries psychrohalotolérantes ont la propriété de croître en présence de sel (jusqu’à
8 %) et à des températures autour de 10 C [4, 46, 60]. Ce groupe comprend de nombreux
genres qui sont généralement associés à des environnements marins, tels que Cobetia,
Halomonas, Pseudoalteromonas et Psychrobacter [7, 8, 12, 45, 61]. La présence de ces
bactéries à la surface des fromages peut s’expliquer par l’utilisation de solutions salines
pour le salage (saumure) et les soins des fromages (solutions salines de lavage) [62]. Dans
ce groupe, le genre le plus souvent impliqué dans l’affinage des fromages est
Glutamicibacter (anciennement appelé Arthrobacter). Ce genre se retrouve dans le sol et

                                             7

à la surface des fromages à croûte lavée. En présence de sel, cette bactérie aérobie et
chimio-organotrophe est la première corynéforme à se développer puisqu’elle est
halotolérante [31]. Les espèces du genre Glutamicibacter jouent un rôle majeur dans
l’affinage des fromages Brick, Vacherin Mont d’Or et Tilsit [63, 64]. Certaines souches
produisent des bactériocines, qui sont des peptides permettant d’inhiber la croissance de
certaines bactéries indésirables [50, 54]. Les Glutamicibacter possèdent des activités
lipolytiques et protéolytiques utiles au développement de la flaveur des fromages et
produisent de l’ammoniaque. L’une des espèces les plus fréquentes, G. nicotianae, est de
couleur jaune et représente environ 30 % des corynéformes présents dans les fromages [4].
D’autres taxons sont également connus, tel que G. arilaitensis, G. citreus, G. globiformis et
G. variabilis, mais ceux-ci sont peu retrouvés dans les fromages [50]. Plusieurs genres
appartenant au groupe des gamma-protéobactéries (Halomonas, Pseudoalteromonas et
Psychrobacter) pourraient participer à l’apparition des propriétés sensorielles par leurs
activités protéolytique et lipolytique. Ce groupe de bactéries est très commun et parfois très
abondant dans plusieurs variétés de fromages français traditionnels [14]. Par exemple, le
genre Psychrobacter est retrouvé chez l’Époisses [14]. Le genre Cobetia se retrouve dans
les environnements laitiers [65] et contribue à l’écosystème des fromages Gorgonzola et de
fromages à croûte lavée [61]. Le genre Halomonas est impliqué dans l’affinage des
fromages Livarot [14]. Les bactéries psychrohalotolérantes se retrouvent aussi chez les
fromages Caciotta [45].

1.2.3   La microflore fongique utile des fromages

Au-delà des bactéries, un grand nombre de champignons microscopiques (levures et
moisissures) contribuent de façon importante au développement des fromages [32]. Les
mycètes inoculés lors de la fabrication sont retrouvés à la fois dans la pâte et à la surface
des fromages. Dans la pâte, ils sont présents à une concentration plus faible que les
bactéries lactiques [29]. En surface, leur importance dépend de la variété de fromage
produite [12]. Les principaux genres de mycètes retrouvés dans les fromages sont
Geotrichum, Debaryomyces, Kluyveromyces et Penicillium.

La principale espèce de Geotrichum utilisée est G. candidum. Cette levure est
dimorphique, c’est-à-dire qu’elle peut présenter un phénotype filamenteux (apparence
blanche et duveteuse) ou levuriforme (colonies ayant l’apparence des « levures », beiges
et crémeuses) [66]. G. candidum est souvent isolée d’environnements laitiers, bien qu’elle

                                              8